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aureus und Enterococcus faecalis in kollagenbasierte Scaffolds zur dermalen Regeneration eingesät.Nach 24 h wiesen die Gerüste je nach anfänglichem Inokulum bakterielle Belastungen auf, die lebensfähige Biofilme mit Antibiotikatoleranz enthielten.Anschließend wurden Gerüste auf Vollhautwunden bei Mäusen implantiert, zusammen mit täglicher Überwachung und Antibiotikabehandlung.Obwohl alle Mäuse überlebten, war ihre Gesundheit beeinträchtigt, sie zeigten Fieber und Gewichtsverlust.Nach zehn Tagen zeigte die Histomorphologie der Gerüste eine hohe Heterogenität in den Proben und innerhalb der Gruppen.Die Wunden waren je nach koloniebildenden Einheiten stark, leicht oder nicht infiziert, und P. aeruginosa wurde häufiger identifiziert.Eine Biofilminfektion induzierte eine Leukozyteninfiltration und erhöhtes Interferon-γ und Interleukin-10 in Gerüsten, eine Zunahme von Größe und Gewicht der Milz und hohe systemische Pro-Calcitonin-Konzentrationen.Dieses funktionelle und implantierbare 3D-Biofilmmodell ermöglicht die Untersuchung der Wirtsreaktion während einer Infektion und bietet ein nützliches Werkzeug für die Entwicklung einer Therapie für infizierte Wunden.Die Wundheilung ist ein zeitlich organisierter Prozess, der mit der Hämostase beginnt, gefolgt von einer Entzündungsphase (1–3 Tage), einer proliferativen Phase (4–21 Tage) und einem Umbau der extrazellulären Gewebematrix (ECM), der zur Wundkontraktion führt (21 Tage–1 Jahr)1.Wenn diese stark regulierten Prozesse nicht fortschreiten, werden Wunden nicht heilen und chronisch werden.Chronische Wunden sind ein ungelöstes medizinisches Problem mit einer ungefähren Prävalenzrate von 1–2 % in der Allgemeinbevölkerung in Industrieländern2, das hauptsächlich ältere Menschen, Diabetiker, fettleibige, bettlägerige, chirurgische Patienten und Menschen mit venöser Insuffizienz3 oder starkem Rauchen betrifft4 .Im Durchschnitt können chronische Wunden 12–13 Monate andauern und die meisten Patienten erkranken trotz Behandlung wieder, was ihre Lebensqualität stark beeinträchtigt5.Etwa 26 % dieser Wunden heilen nie und enden mit geringfügigen Amputationen6.Tatsächlich geht weltweit 85 % der Amputationen eine chronische Wunde voraus7 und innerhalb von 5 Jahren starben 70 % der Diabetiker mit Amputationen8.Chronische Wunden beeinträchtigen nicht nur die Lebensqualität der Patienten, sondern stellen auch eine große wirtschaftliche Belastung dar, da allein die Behandlungskosten schätzungsweise 1–3 % des gesamten Gesundheitsbudgets in Industrieländern ausmachen9.Etwa 60 % der chronischen Wunden werden durch die anhaltende Infektion etablierter Multispezies-Biofilme verursacht, die den Regenerationsprozess beeinträchtigen10.Mehrere Bakterienarten können das Wundbett besiedeln und lebensfähige Biofilme bilden, eine Lebensweise, bei der sie in eine selbst hergestellte polymere Matrix oder „extrazelluläre polymere Substanzen“ (EPS) eingebettet sind11.Diese dreidimensionale Struktur bietet bakteriellen Biofilmen eine optimale Umgebung, um den Immunantworten des Wirts zu entgehen und eine antibiotische Behandlung zu tolerieren12.Im Gewebe verursacht die anhaltende Biofilminfektion einen anhaltenden chronischen Entzündungszustand, der den normalen Heilungsprozess stört12.Darüber hinaus provozieren Biofilme eine Gewebehypoxie, indem sie Sauerstoff13,14 sowie verschiedene aus dem Exsudat gewonnene Nährstoffe verbrauchen und so den Zellen die für die Regeneration erforderliche Energie entziehen15.Darüber hinaus induzieren Biofilme eine Fehlfunktion der epithelialen Tight Junctions, was zu einem transepidermalen Wasserverlust16 führt, wodurch die Hautbarrierefunktion verloren geht und neue Bakterienzellen sich ansiedeln und wachsen können.Biofilme, die chronische Wunden infizieren, sind in der Regel multispezies und enthalten vorwiegend Krankheitserreger wie Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus und Enterococcus faecalis sowie kommensale Arten wie Corynebacterium spp.und Staphylococcus epidermidis17.Die etablierten Biofilme können eine bakterielle Belastung von 105 koloniebildenden Einheiten (CFU)/Gramm Wundgewebe überschreiten, wie durch Wundkulturen von Tiefengewebebiopsien, Nadelaspiration und Abstrichkulturen bestimmt wurde18, was als Marker für eine Infektion bei chronischen Wunden vorgeschlagen wurde10 , unabhängig von ihrer mikrobiellen Zusammensetzung19.Es wurde auch berichtet, dass 93 % aller chronischen Wundinfektionen Multispezies sind, während nur 7 % davon Einzelspezies sind, die häufig von P. aeruginosa-Stämmen dominiert werden17.Eine Prävalenz anspruchsvoller pathogener Stämme wurde in Biofilmen von chronischen Wunden von Patienten mit Verbrennungen festgestellt, wo Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) und Vancomycin-resistente Enterococcus (VRE)-Stämme eine Breitband-Antibiotika-Toleranz aufweisen20,21.Aufgrund seiner kritischen Bedeutung wurden In-vitro- und In-vivo-Biofilmmodelle entwickelt, um ihre Rolle bei der Wundheilung zu untersuchen.Einige dieser Modelle umfassen Biofilme, die auf klinischen Wundversorgungsmaterialien wie Nähten22, absorbierenden Pads23, Gaze24, silberbeschichteten25 oder antimikrobiellen Wundverbänden26 gebildet werden.Andere Modelle haben biologische Substrate für die Biofilmbildung verwendet, wie z. B. Plasma mit roten Blutkörperchen des Pferdes27, menschliches Plasma28, kollagenbeschichtete Objektträger29, Kollagengel30, ein Gerüst aus Hyaluronsäure und Kollagen31 und Hautexplantate für Ex-vivo-Modelle32.Diese Modelle ermöglichten die Charakterisierung von Biofilm-Phänotypen, die Anheftung von Zellen an Materialien und das Testen neuartiger antimikrobieller Mittel, aber die meisten von ihnen wurden nicht für eine anschließende In-vivo-Analyse implantiert.Nahtmodelle von Monospezies-Infektionen wurden in Mäuse implantiert, aber der Verwendung von Monospezies-Modellen fehlt die polymikrobielle Natur von Biofilmen in tatsächlichen Wunden33.Es wurden auch mehrere In-vivo-Modelle etabliert, hauptsächlich bei Mäusen und Schweinen, und die meisten von ihnen beruhen auf der Verwendung einer Einzelspezies-Inokulation von Pseudomonas spp.oder Staphylococcus spp.im planktonischen Zustand, die Biofilme bilden und Gewebeschäden34, kollagenolytische MMP-2-Aktivität und Hemmung der Kollagensynthese35 oder sogar Blutvergiftung36 hervorrufen können, was zu verzögerter Wundheilung führt.Andere Autoren haben Zwei-Spezies-Kombinationen verwendet, um Wunden bei Mäusen für Wirksamkeits- und Sicherheitstests von Glykosidhydrolasen zu infizieren37, bei Pferden, um eine normale und beeinträchtigte Regeneration zu bewerten38, oder bei Schweinen, die eine Störung der Hautbarrierefunktion verursachten16,27.In Bezug auf die Wunddynamik erfolgt die Regeneration in Mausmodellen hauptsächlich durch Kontraktion und nicht durch die Regeneration, die die Heilung menschlicher Wunden vorantreibt38.In Bezug auf den Infektionsprozess haben diese Modelle zwar wertvolle Erkenntnisse in Bezug auf Biofilmvirulenz, Wundverschluss und bakterielle Belastung geliefert, die meisten von ihnen haben jedoch nicht die systemischen und lokalen Auswirkungen einer Biofilminfektion auf allgemeine Gesundheitsparameter des Wirts und wie solche Biofilme charakterisiert beeinflussen den Wundheilungsprozess.Unter Berücksichtigung der oben genannten Aspekte war das Ziel dieser Arbeit, ein zuverlässiges In-vitro- und In-vivo-Modell zu etablieren, das den dreidimensionalen komplexen Wechselwirkungen ähnelt, die zwischen dem Multispezies-Biofilm und dem biologischen Substrat sowie den Wechselwirkungen zwischen Wirt und Pathogenen bestehen. und ihre Wirkung während des Wundheilungsprozesses.Wie im Material- und Methodenteil beschrieben, wurde eine Mischung aus P. aeruginosa, S. aureus und E. faecalis in ein kollagenbasiertes 3D-Scaffold eingebaut, das klinisch zur dermalen Regeneration verwendet wird (Abb. 1).Nach 24 h Inkubation blieben die Bakterien metabolisch aktiv, wie durch die Bildung von Formazanblau im MTT (1-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan)-Assay gezeigt wurde.Die makroskopische Visualisierung der Vorderansicht des Gerüsts (Abb. 2A, oberes Bild) zeigte eine homogene Verteilung der Bakterien über die Proben mit geringer Bakterienbelastung, während bei Proben mit höherer Belastung eine Zunahme der Bildung von Formazanblau in der Mitte der Gerüste beobachtet wurde .Sowohl bei Belastungen mit niedriger als auch mit hoher Dichte zeigte eine stärkere Vergrößerung das Vorhandensein von Bakterien, die an den Gerüstfasern haften und eine dreidimensionale Struktur bilden.Seitenansichtsbilder zeigen eine homogene vertikale Verteilung bei geringerer Bakterienbelastung, wobei Bakterienaggregate gleichmäßig über die Gerüste verteilt sind, während Kristalle vorwiegend im oberen Bereich der Gerüste konzentriert waren, wenn Bakterien bei höheren Belastungen ausgesät wurden (Abb. 2A, unteres Feld).Schematische Darstellung des In-vitro- und In-vivo-Biofilmmodells.(A) Stämme von P. aeruginosa, S. aureus und E. faecalis wurden verdünnt und auf Kollagengerüsten ausgesät, um die Bildung von Biofilmen zu induzieren.Nach 24 h Inkubation wurde das Biofilm-in-vitro-Modell hinsichtlich metabolischer Aktivität, bakterieller Belastung, Struktur und Antibiotikatoleranz analysiert.(B) Nach der Charakterisierung wurden biofilmhaltige Gerüste 10 Tage lang in bilaterale Vollhautdefekte bei Mäusen implantiert, um die Wirkung auf allgemeine Gesundheitsparameter durch tägliche Überwachung zu bewerten.Weitere Analysen der Tierproben wurden durchgeführt, einschließlich Histologie und Immunhistochemie, Bakterienbelastung, Pro-Calcitonin- und Zytokinspiegel.Bild wurde mit BioRender erstellt.Lebensfähigkeit, Verteilung und bakterielle Belastung von in Gerüsten gebildeten Biofilmen.(A) MTT-Assay von Gerüsten, die mit 102 oder 108 Zellen/ml oder ohne Zellen (Kontrolle) ausgesät und 24 h inkubiert wurden, zeigte eine gleichmäßige Verteilung lebensfähiger Biofilme über die Gerüste in Vorder- und Seitenansicht.Bei stärkerer Vergrößerung der Gerüste wurde eine Bakterienansammlung beobachtet (Pfeilspitzen).(B) Quantifizierung zeigt, dass die metabolische Aktivität entsprechend der anfänglichen Zelldichte zunahm.(C) Biofilm-haltige Gerüste wurden verdünnt und in TSS-Agar für die CFU-Zählung plattiert.Die Quantifizierung zeigt über 105 KBE/Gerüst nach 18-stündiger Inkubation der Gerüste und bis zu 1010 KBE/Gerüst nach 72-stündigem Bakterienwachstum.Maßstabsleiste für A repräsentiert 10 mm (Vorderansicht), 50 µm (oberer Zoom), 0,5 mm (Seitenansicht), 240 µm (unterer Zoom).Die aufgetragenen Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung (N = 3).Einfache ANOVA und Posterior-Vergleich nach Tukey für B und ungepaarten t-Test, wobei jeder Zeitpunkt mit seiner vorherigen Bedingung für C verglichen wird. *p < 0,05;*** p < 0,001.Bei nicht besäten Kontrollgerüsten wurde keine MTT-Reduktion beobachtet, wohingegen eine quantitative Analyse einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen zeigte, die mit hoher und niedriger Bakterienlast besät wurden, was nicht direkt proportional zur Anzahl der besäten Bakterien war (Abb. 2B).Die CFU-Zahlen pro Gerüst betrugen 102 CFU/mL am Tag 0 (Abb. 2C) und stiegen auf 106 CFU/mL in 24 h an und erreichten 1010 CFU/mL in 48 h (Abb. 2B).Um die Struktur von ausgesäten Mikroorganismen über dem Biomaterial sichtbar zu machen, wurden Gerüste mit verschiedenen mikroskopischen Techniken analysiert.Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)-Analyse zeigte Bakterienaggregate, die an der Oberfläche des Gerüsts hafteten und eine biofilmähnliche Struktur bildeten, die in den Gerüsten, die mit höheren Bakterienlasten besät waren, stärker ausgeprägt war (Abb. 3A, obere Tafeln).Die Z-Ansicht zeigt, dass Bakterien homogen in der Oberfläche verteilt sind, wobei sich Bakterienkolonien in den inneren Hohlräumen des Materials etabliert haben (Abb. 3A, untere Felder).Die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) ergab eine detailliertere Analyse der Biofilmstruktur, die eine eher glatte Oberfläche bei den unbesäten Kontrollgerüsten zeigte, im Vergleich zu Gerüsten, die Bakterien enthielten, die die Oberfläche des Materials bei höheren Bakterienbelastungen vollständig besiedeln (Abb. 3B ).Darüber hinaus zeigten SEM-Bilder, dass die meisten Bakterien, die in biofilmhaltigen Gerüsten entdeckt wurden, stäbchenförmige Zellen sind, die in beträchtliche Mengen an extra polymerer Substanz (EPS) eingebettet sind.Mikroskopische Charakterisierung von in den Gerüsten gebildeten Biofilmen.(A) Feste Gerüste wurden mit PI (rot) und DAPI (blau) für die CLSM-Visualisierung gefärbt, was die Bildung von Biofilmen auf Gerüstfasern und Bakterienaggregaten zeigt (vergrößerte rechte Tafeln).Seitenbilder von den linken Feldern stellen eine Z-Ansicht von zwei optischen Abschnitten (X- und Y-Ansicht) von dem Gerüst dar.(B) SEM-Analyse zeigt einzelne Zellen (Pfeilspitzen) und Bakterienaggregate (Pfeile) mit EPS-Bildung (vergrößerte rechte Felder).Maßstabsbalken für A repräsentieren 50 µm (linkes Feld) und 10 µm (rechtes Feld);für B stehen 12 um (linkes Feld), 5 um (rechtes Feld).In A ist aufgrund von Kollagen-Autofluoreszenz in allen Gruppen ein blaues Signal vorhanden.Nachdem das Vorhandensein lebensfähiger Biofilme in 3D-Gerüsten bestätigt war, beschlossen wir, ihre Funktionalität im Hinblick auf die Antibiotikatoleranz zu untersuchen, indem wir sie mit Planktonkulturen derselben Art verglichen.Biofilmhaltige Scaffolds und bakterielle Planktonsuspensionen wurden mit hohen Konzentrationen von Ciprofloxacin oder Gentamicin behandelt und deren antibiotische Wirkung analysiert (Abb. 4).Die mikroskopische Visualisierung von Gerüsten zeigt eine deutliche Verringerung der bakteriellen Biofilm-Biomasse nach der Behandlung mit jedem Antibiotikum, wobei Bakterien, die direkt an das Gerüst gebunden sind, eine Biofilm-ähnliche Struktur bewahrten (Abb. 4A), die unabhängig davon an Hohlräumen innerhalb der Poren des Biomaterials haften blieben der Antibiotika-Typ.Ein Assay der minimalen Hemmkonzentration (MIC) von Planktonkulturen (ergänzende Abb. S1) zeigte, dass eine Konzentration von 10 µg/ml Gentamicin und 1 µg/ml Ciprofloxacin das Wachstum und die Aktivität von Planktonbakterien hemmte, was durch Messung von OD 600 bestätigt wurde nm und XTT (2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilid)-Reduktionsassays.Um diesen Effekt zu quantifizieren, zeigte ein XTT-Assay von Planktonkulturen und biofilmhaltigen Gerüsten, die mit Antibiotika behandelt wurden (Abb. 4B), keine metabolische Aktivität für Planktonzellen, während Biofilme nach der Behandlung mit jedem Antibiotikum lebensfähig blieben.In Kontrollmedien wurden keine statistischen Unterschiede zwischen Plankton- und Biofilmzellen gefunden.Breitband-Antibiotika-Behandlung von Biofilmen, die sich in den Gerüsten gebildet haben.(A) Mit Antibiotika behandelte Biofilm-haltige Gerüste wurden fixiert und mit PI (rot) und DAPI (blau) für die konfokale Mikroskopie-Visualisierung gefärbt, die verbleibende Biofilme zeigt.Seitenbilder von den linken Feldern stellen eine Z-Ansicht von zwei optischen Abschnitten (X- und Y-Ansicht) von dem Gerüst dar.(B) Lebensfähigkeitsassay (XTT) von Biofilmen, die über Gerüsten gebildet und mit Antibiotika behandelt wurden, bestätigt eine signifikant höhere Stoffwechselaktivität im Vergleich zu Planktonkulturen.Skalenbalken stellen 50 µm in A dar. Die aufgetragenen Werte sind Mittelwerte ± SD (N = 3).Zweiweg-ANOVA und Mehrfachvergleichstest nach Sidak.*** p < 0,0001.In A ist aufgrund von Kollagen-Autofluoreszenz in allen Gruppen ein blaues Signal vorhanden.Nach der Charakterisierung des In-vitro-3D-Biofilmmodells wurde eine In-vivo-Studie durchgeführt.In einem Pilotversuch wurden biofilmhaltige Gerüste auf beidseitige Vollhautwunden bei Mäusen implantiert.Trotz angemessener Analgesie, Tierpflege und Kauterisation blutender Gefäße während der Operation starben alle Mäuse nach ein bis zwei Tagen nach der Implantation an Sepsis (ergänzende Abb. S2).Um dies zu verhindern, umfassten weitere In-vivo-Assays die Verwendung von antibiotischen und fiebersenkenden Behandlungen.Ciprofloxacin und Meloxicam wurden den Tieren täglich verabreicht ( 5A ), was zu 100 % Überleben der Mäuse nach Implantation des biofilmhaltigen Gerüsts führte.Während der ersten zwei Tage zeigten einige Mäuse Blutungen um die Nahtknoten herum, und nach zehn Tagen gab es in beiden Gruppen weder Anzeichen von Blutungen um die Gerüste noch signifikante Wundkontraktionen (Abb. 5B).Implantierte sterile Scaffolds (Kontrolle) zeigten keine makroskopischen Zeichen einer Infektion oder Entzündung.Im Gegensatz dazu zeigten einige Tiere mit biofilmhaltigen Scaffolds ein gelbes Sekret in den umgebenden Wundbereichen oder unter dem Scaffold (Abb. 5B).Zeitlicher Verlauf des Wohlergehens von Mäusen während 10 Tagen Biofilmimplantation.(A) Zeitleiste des In-vivo-Modells, die den Behandlungs- und Überwachungszeitpunkt zeigt: Ciprofloxacin IP 30 mg/kg (rot), Operation (schwarz), Meloxicam SC 5 mg/kg (grau), Euthanasie (blau).Alle Tiere wurden täglich gemäß ethischen Protokollen zur allgemeinen Gesundheitsbewertung überwacht.(B) Repräsentative Bilder von Kontroll- oder Biofilm-infizierten Wunden im Scaffold-Hautregenerationsmodell unmittelbar nach der Operation (Tag 0) und nach 10 Tagen Implantation (Tag 10).Die Pfeilspitze zeigt ein Sekret an, das den Wundbereich umgibt.(C) Gesundheitswert zur Bewertung des Wohlergehens, der anzeigt, dass die Biofilminfektion die Gesundheit der Tiere von Tag 3 bis Tag 10 beeinträchtigt. (D) Relatives Körpergewicht (% des Anfangsgewichts am Tag 0), zeigt, dass sich die Biofilm-infizierte Gruppe nicht erholte ihr Gewicht.(E) Die Körpertemperatur zeigt, dass die mit Biofilm infizierte Gruppe an anfänglichem Fieber leidet, sich aber in den letzten Tagen stabilisiert.Der Maßstabsbalken stellt 10 mm für B dar. Die aufgetragenen Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung (N = 8 pro Gruppe).Zweiweg-ANOVA und Mehrfachvergleichstest nach Sidak.* p < 0,05;** p < 0,01;*** p < 0,001.Eine tägliche Überwachung der Tiergesundheit zeigte eine nachteilige Wirkung der Biofilmimplantation auf globale Gesundheitsparameter (Abb. 5C).Somit war der aus dem täglichen Überwachungsleitfaden erhaltene Gesundheitswert seit Tag 3 bei Mäusen, denen biofilmhaltige Gerüste implantiert wurden, signifikant erhöht.Zwischen beiden Gruppen wurde auch ein signifikanter Unterschied im Körpergewicht beobachtet, da mit Biofilm implantierte Mäuse ihr ursprüngliches Gewicht nicht wiedererlangten (Abb. 5D).Schließlich zeigte die biofilmimplantierte Gruppe während der ersten vier Tage einen signifikanten Anstieg der Körpertemperatur am Rücken der Mäuse, der sich nach fünf Tagen erholte (Abb. 5E).Als nächstes wurden Gerüste entfernt und die Auswirkung eines möglichen Infektionsprozesses untersucht.Hier wurden Paraffinschnitte von biofilmhaltigen Gerüsten vor der Implantation und nach zehn Tagen in vivo geschnitten und für die histologische Analyse gefärbt (Abb. 6A).Bakterienaggregate wurden hauptsächlich im oberen Bereich des Biomaterials vor der Implantation angesammelt, aber nach zehn Tagen waren solche Bakterienaggregate weit über das Gerüst verteilt.Sterile implantierte Gerüste zeigen eine Zellularisierung von Fibroblasten ohne Leukozyteninfiltration im Vergleich zu Biofilm-implantierten Gerüsten, die eine beträchtliche Menge polymorphkerniger (PMN) Zellen zeigten, die in eine reichlich vorhandene Biofilmstruktur eingebettet waren.Mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbte Schnitte der Haut um den Wundbereich herum (Fig. 6B) zeigten keine wesentlichen Unterschiede aufgrund des Vorhandenseins von Bakterien, mit Ausnahme eines erhöhten Vorhandenseins von Leukozyteninfiltrat im Fettgewebe des Biofilmmodells.Infektion von Wunden nach Implantation von biofilmhaltigen Scaffolds.(A) Histologische Schnitte von Gerüsten in vitro (vor der Implantation) und in vivo (10 Tage nach der Implantation) wurden mit H&E gefärbt.(B) Histologische Schnitte von Hautproben des Wundrandes wurden mit H&E gefärbt und zeigten eine Infiltration von Leukozyten in das Fettgewebe (rechte untere Felder), aber nicht in die Epidermisschicht (linke untere Felder).(C) Histologische Immunfärbung, die Bakterienaggregate zeigt, die jeder Bakterienart entsprechen.(D) Gerüstproben wurden verdünnt und in TSS-Agar zur CFU-Bestimmung ausplattiert, die in vitro (N = 11) über 106 CFU/g und in der In-vivo-Gruppe (N = 21) 109 CFU/g zeigten.(F) Die Pro-Calcitonin-Spiegel wurden aus Plasma von Tieren gemessen, denen sterile Gerüste (Kontrolle), Biofilm-haltige Gerüste mit Antibiotika (Biofilm) und Biofilm-haltige Gerüste ohne Antibiotika, die Septikämie hervorrufen (Sepsis), implantiert wurden.Maßstabsleiste für A repräsentiert 1000 µm (links) und 60 µm (rechts);für B stellt 1000 um (obere) und 60 um (untere) dar;für C bedeutet 20 um.Einzelwerte und Mittelwert (rote Linie) sind aufgetragen.Ungepaarter t-Test, Vergleich mit entsprechender vorheriger Gruppe.* p < 0,05.Um eine systemische Infektion oder Kreuzkontamination von Proben zu verwerfen, wurde von Tieren gesammeltes Blut auf CFU-Zählung analysiert.Die Ergebnisse zeigten, dass in beiden Gruppen kein Bakterienwachstum auf Blutagarplatten beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt).Um das Vorhandensein und die Verteilung von in das Gerüst eingesäten Bakterienspezies zu bestätigen, wurden diese in situ unter Verwendung spezifischer Antikörper identifiziert (Fig. 6C).Dann wurden die CFU/g der Gerüste quantifiziert (Fig. 6D), wobei die Gerüste vor der Implantation (in vitro) und nach zehn Tagen in vivo verglichen wurden.Kontrollgerüste erwiesen sich als steril, ohne Bakterienwachstum, während Biofilm enthaltende Gerüste in vitro Mittelwerte von 107 KBE/g aufwiesen.Nach der Implantation in Wunden voller Dicke erreichten die Biofilme trotz der Ciprofloxacin-Therapie über 109 KBE/g Gerüst.Um den durch Biofilme induzierten Infektionsprozess weiter zu bewerten, wurden Pro-Calcitonin-Spiegel im Serum quantifiziert (Fig. 6E).Obwohl die Pro-Calcitonin-Basalspiegel bei Tieren, denen sterile Gerüste (Kontrolle) implantiert wurden, hoch waren, führte die Biofilmimplantation zusammen mit einer Antibiotikatherapie zu signifikant erhöhten Spiegeln mit über 500 pg/ml Pro-Calcitonin (Biofilm), während Tiere, die an Septikämie litten ( N = 3) verursacht durch Biofilmimplantation ohne Antibiotika (Sepsis) erreichte Werte über 1.500 pg/mL.Um Bakterienarten in den Gerüsten zu identifizieren, wurde eine MALDI-TOF-MS-Analyse (Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) durchgeführt (ergänzende Abb. S3), die das Vorherrschen von P. aeruginosa in 90 % der Proben vor und zeigt Nach 10 Tagen Implantation wiesen 10 % der Proben E. faecalis und 10 % S. aureus auf.Auch mehrere andere Bakteriengattungen, die ursprünglich nicht inokuliert wurden, wurden in kolonisierten Wunden gefunden, aber sie waren spezifisch für jede spezifische Wunde, wobei 20 % der Proben Kocuria rosea, 10 % Escherichia coli, 10 % Pseudarthrobacter sulfonivorans und 10 % hatten Pseudomonas straminea mit insgesamt sieben Bakterienarten, die in Biofilm enthaltenden Gerüsten aus dieser Studie nachgewiesen wurden (Daten nicht gezeigt).Nach Bestätigung einer lokalen Infektionsreaktion, die durch die Biofilmimplantation in Wunden hervorgerufen wurde, wurde ihre Wirkung auf den systemischen Entzündungsprozess charakterisiert (Abb. 7).Für die systemische Entzündungsanalyse wurden Blut und lymphatische Organe entnommen.Aufgrund der Biofilmimplantation wurde eine vergrößerte Milz beobachtet (Abb. 7A), die durch eine signifikante Gewichtszunahme im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 7B) bestätigt wurde.Lymphknoten und Thymus zeigten keine Variationen in Größe oder Gewicht unter Biofilminfektion (Abb. 7A, B).Die mikroskopische Untersuchung von mit H&E gefärbten histologischen Schnitten der Milz zeigte eine Zunahme des Verhältnisses von Lymphfollikeln/Milzfläche und der durchschnittlichen Menge an Lymphfollikeln in den Biofilm-infizierten Gruppen (Abb. 7C).Systemische und lokale Entzündungsreaktion von Mäusen auf biofilmhaltige Gerüste.(A) Repräsentative Bilder von Immunorganen zeigen eine erhöhte Größe der Milz aufgrund der Biofilmimplantation.(B) Organgewicht im Verhältnis zum Gesamtkörpergewicht von Mäusen zeigt eine signifikante Zunahme der Milz aufgrund einer Biofilminfektion, während Thymus und Lymphknoten keine Unterschiede zeigen.(C) Morphometrische Analyse von mit H&E gefärbten Milzschnitten zur Quantifizierung der Lymphfollikel pro Milzbereich und der durchschnittlichen Anzahl von Lymphfollikeln pro Probe.(D) Plasmaproben von Mäusen, denen sterile Gerüste (Kontrolle), mit Biofilm enthaltenden Gerüsten und systemischer Behandlung mit Ciprofloxacin (Biofilm + Antibiotikum) oder ohne Antibiotika (Biofilm – Antibiotikum) implantiert wurden, wurden auf die Quantifizierung proinflammatorischer Zytokine analysiert.Nur Tiere mit infizierten Gerüsten und ohne systemische Behandlung hatten signifikant höhere Zytokinspiegel.(E) Proteinextrakte aus den implantierten Gerüsten wurden analysiert und zeigten höhere IFN-γ- und IL-10-Werte aufgrund einer Biofilminfektion.(F) Histologische Schnitte von biofilmhaltigen oder Kontrollgerüsten nach der Implantation wurden für die Immunhistochemie mit CD68-Antikörper (Makrophagen) und Masson-Trichrom-Färbung (Neutrophile) verarbeitet.Repräsentative Bilder zeigen die Infiltration von Makrophagen und PMN-Zellen in Gegenwart von Biofilm.Maßstabsleiste für A stellt 5 mm dar;für F bedeutet 60 um.Einzelwerte und Mittelwert (rote Linie) sind aufgetragen.Zweiweg-ANOVA und Mehrfachvergleichstest nach Sidak für B und E;Mann-Whitney-Test für C;und Zweiweg-ANOVA und Tukey-Posteriori-Vergleich für D. *p < 0,05;** p < 0,01;**** p < 0,0001.Um systemische entzündungsfördernde Zytokine zu quantifizieren, wurde Blut von implantierten Tieren entnommen und die Plasmafraktion wurde durch Durchflusszytometrie analysiert ( 7D ).Keines der gemessenen Zytokine zeigte signifikante Unterschiede zwischen den mit Ciprofloxacin behandelten Gruppen (Kontroll- oder Biofilm-infizierte Gruppen).Im Gegensatz dazu zeigten die Zytokinspiegel von Tieren mit biofilmhaltigen Gerüsten, die nicht mit Antibiotika behandelt wurden und an Septikämie litten, erhöhte Spiegel für die Zytokine MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), IL-10 und IL-6 im Vergleich zu den behandelten Gruppen mit Ciprofloxacin und Kontrolle (Suppl. Abb. S2).Sobald die systemische Entzündungsreaktion bewertet wurde, wurde auch der lokale Entzündungsprozess untersucht (Abb. 7E, F).Hier wurden Zytokine, die aus Proteinextrakten der implantierten Gerüste erhalten wurden, quantifiziert und zeigten signifikant höhere Spiegel von IFN-γ und IL-10 in infizierten Proben im Vergleich zu sterilen (Abb. 7E).Um die Leukozyteninfiltration zu bewerten, wurden histologische Schnitte von Gerüsten für eine immunhistochemische und histochemische Analyse verarbeitet, um Makrophagen und Neutrophile nachzuweisen (Fig. 7F).Die Ergebnisse zeigen, dass es in Gegenwart von Biofilm eine deutliche Reaktion des Wirts gab, was durch die höhere Anwesenheit von Makrophagen und Neutrophilen im Gerüst gegeben ist.Um die Wirkung des Biofilms auf den Regenerationsprozess qualitativ zu beurteilen, wurden Paraffinschnitte für Massons Trichromfärbung und Immunhistochemie verarbeitet (Abb. 8).Die Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von Endothelzellen, die mit Differenzierungscluster 31 (CD31, Abb. 8A), Myofibroblasten mit Alpha-Glattmuskel-Aktin (α-SMA, Abb. 8B) und Zellen unter Zellproliferation (ki67, Abb. 8C) markiert sind. konsistent mit dem Regenerationsprozess bei Kontrolltieren, denen sterile Gerüste implantiert wurden.Bei Biofilm-infizierten Gruppen wurden diese Marker nicht sichtbar gemacht, während eine hohe Anzahl von Leukozyteninfiltraten beobachtet wurde.Regenerationsparameter in vivo.Histologische Schnitte von Biofilm-enthaltenden oder Kontrollgerüsten nach zehn Tagen Implantation wurden für die Immunhistochemie mit spezifischen Antikörpern verarbeitet und ein qualitativer Assay durchgeführt.(A) Endothelzellen als Indikator für Angiogenese, analysiert mit CD31.(B) Aktivierung von Fibroblasten an der mit α-SMA-Antikörper analysierten Wundstelle.(C) Zellproliferation, analysiert mit KI67-Antikörper.Positiv gefärbte Zellen sind mit Pfeilspitzen gekennzeichnet.Der Maßstabsbalken entspricht 60 µm.Trotz jahrzehntelanger Forschung ist die Rolle der Biofilm-vermittelten Infektion bei chronischen Wunden noch nicht vollständig aufgeklärt, daher die Entwicklung von In-vitro- und In-vivo-Biofilmmodellen, um ihre Biologie sowie ihre Rolle im Regenerationsprozess besser zu verstehen erforderlich, um neue Strategien für das Management chronischer Wunden zu entwickeln.Das Ziel dieser Arbeit war es daher, ein Biofilm-infiziertes In-vitro-Modell zu etablieren, das weiter in ein Wundmodell implantiert werden kann, um die Wirkung von Biofilmen in vivo zu bewerten.Zunächst wurden Bedingungen geschaffen, um Biofilme in kommerziell erhältlichen Gerüsten auf Kollagen-GAG-Basis wachsen zu lassen, die der extrazellulären Hautmatrix in Bezug auf Struktur und Zusammensetzung ähneln, die in der Forschung und für ihre klinische Verwendung zur Hautregeneration umfassend beschrieben wurde39.Unter Verwendung eines MTT-Assays, bei dem Formazankristalle intrazellulär verbleiben40, wurden lebensfähige Bakterien innerhalb des Biomaterials lokalisiert und quantifiziert40.Die Ergebnisse bestätigten die Bildung eines metabolisch aktiven Biofilms, der sich auf der Oberfläche des Biomaterials bildete, der bei Biofilmen mit geringer Zelldichte homogen verteilt war, während sich diejenigen, die durch hohe Bakterienlasten gebildet wurden, in der Mitte und am Boden des Gerüsts befanden.Dies deutet auf die Bildung von metabolischen Gradienten aufgrund der chemischen Gradienten von Sauerstoff oder Nährstoffen hin11, die mit ihrer Fähigkeit korrelieren können, Antibiotika zu vertragen41.Die CLSM- und SEM-Analyse war konsistent und zeigte, dass Biofilme in Bakterienaggregaten organisiert waren, die an den Poren des Gerüsts hafteten.Möglicherweise begann die Biofilmbildung mit Bakterien, die sich an der Oberfläche anheften und sich vermehren, wobei sie EPS absondern, um nach einem typischen Wachstumszyklus zu einem dickschichtigen Biofilm im Gerüst zu werden42,43.Im vorliegenden In-vitro-Modell wurde die Toleranz gegenüber der Behandlung mit Ciprofloxacin und Gentamicin in Biofilmen bestätigt, die sich über Kollagengerüsten bildeten, wie zuvor für P. aeruginosa über Gelen (mit 102 KBE/Gel nach 24 h)30 und Biofilmen gemischter Spezies in der Lubbock-Modell, das nach 5 h44 etwa 105 bis 106 CFU/g Gewebe erreicht.Unsere Ergebnisse zeigten einen 100- und 20-fachen Anstieg der MHK von Ciprofloxacin und Gentamicin für Bakterien, die Biofilme bilden, im Vergleich zu Plankton, wie für Biofilme bei chronischen Wunden beschrieben45,46, was darauf hinweist, dass das vorgeschlagene In-vitro-Modell lebensfähig und funktionsfähig ist.Darüber hinaus bestätigten In-vivo-Ergebnisse, dass die Therapie mit Ciprofloxacin Septikämie verhindert, da eine bakterielle Inokulation ohne Behandlung zu einer 100%igen Sterblichkeit von Mäusen führte, ein Ergebnis, über das zuvor bei Mäusen und Pferdemodellen berichtet wurde36,38,47.Trotz der täglichen Ciprofloxacin-Dosis von 10 mg/kg erzeugte die Biofilmimplantation eine anhaltende Infektion mit nachteiligen Auswirkungen auf das Tierwohl, wie sich in einem höheren Gesundheitswert, dauerhaftem Gewichtsverlust und anfänglichem Fieber zeigt, was der stark beeinträchtigten Lebensqualität von Patienten mit chronischen Wunden ähnelt5 .Das hier beschriebene Modell zeigt, dass ein anfängliches Inokulum mit niedriger Dichte nach 24 h Biofilme von 108 KBE/ml bilden und nach zehn Tagen in vivo über 109 KBE/g Gewebe erreichen kann, was einer klinisch relevanteren anfänglichen bakteriellen Exposition gegenüber Patienten ähnelt48.In ähnlicher Weise ergab die CFU-Zählung Gruppen von nicht infizierten, leicht oder stark infizierten Wunden, die mit Gradienten der Infiltration und Migration von PMN-Zellen und Makrophagen korrelierten, die durch Histologie sichtbar gemacht wurden.Diese Beobachtung ahmt die Kategorisierung der Wunden des Patienten in „leicht“, „gelegentlich“, „mäßig“ oder „stark wachsende“ Infektionen nach49.In Bezug auf die bakterielle Diversität50, obwohl Pseudomonas den Infektionsprozess bei den meisten Tieren dominierte, gab es eine weniger häufige Anwesenheit von S. aureus, E. faecalis und die gelegentliche Identifizierung von sieben Bakterienarten aus Mäusen und der Umwelt, was darauf hindeutet, dass das vorgeschlagene Gerüst infiziertes Modell hat eine heterogene polymikrobielle und dynamische Zusammensetzung wie chronische Wunden17.Auf systemischer Ebene zeigen eine vergrößerte Milz und histologische Analysen, dass die Implantation von biofilmhaltigen Gerüsten eine Splenomegalie induziert, mit einer erhöhten Größe und Anzahl von Lymphfollikeln, in denen sich Lymphozyten T und B differenzieren und vermehren52, was wahrscheinlich auf eine hohe immunologische Aktivität der Milz hindeutet als Reaktion auf bakterielle Lipopolysaccharide, wie zuvor berichtet wurde53.Darüber hinaus waren die Pro-Calcitonin-Spiegel bei Biofilm-infizierten Gruppen im Vergleich zu Kontrollen signifikant höher, wobei die Proteinkonzentrationswerte im Plasma innerhalb der angegebenen Bereiche für chronisch infizierte Patienten lagen54,55, was zeigt, dass neben schädlichen Auswirkungen auf das Wohlbefinden auch andere systemische Wirkungen auftreten mimics patient's symptoms were also present.Int.N. Engl.J.Med.Nat.Int.Int.Int.Int.Immunol.Immunol.Med.Immunol.Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenJeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:Leider ist für diesen Artikel derzeit kein teilbarer Link verfügbar.Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt